植物组织原位杂交-贝科新肽科技公司(在线咨询)

将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟，迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。

杂交结束后，植物组织原位杂交，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗 一次，同时应避免膜干涸。

68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃将滤膜浸泡60分钟。

荧光原位杂交（FISH）技术具有以下优点：

高特异性：荧光探针的合成是定向的，保证了杂交过程的特异性，可以有效地降低非特异性杂交和背景干扰。

高灵敏度：荧光信号的检测比性信号的检测更灵敏，可以检测出低拷贝数的DNA序列，甚至可以检测单个基因序列。

快速简便：FISH技术操作简便，杂交过程可以在数小时或数天内完成，而且不需要过于复杂的设备，便于在实验室开展。

一. 原位杂交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分钟。

2） 置换成30％的PBST溶液，放置5分钟

3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次

4） 置换成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟

5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

 蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。