动物组织原位杂交-武汉贝科新肽公司

原位杂交第二天

1.

1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，动物组织原位杂交，重复一次。

2.

1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。

2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。

3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连，4C 冰箱过夜。

把滤膜放在纸巾上于室温晾干后，把滤膜（编号面朝上）放在一张保鲜膜上，并在保鲜膜上作几个不对称的标记，以使滤膜与性自显影片位置对应。

用第二张保鲜膜盖住滤膜。加光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小时。

底片显影后，在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置，同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸，通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。

和其它实验方法一样，必须同时设对照试验以证明其实验结果特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定。ISHH的优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。应用高敏感度的性标记cRNA探针在理想的ISHH的实验条件下检测mRNA，其敏感度可达到20个mRNA拷贝/每个细胞。由于双链DNA的稳定性，在用ISHH定位DNA时很少发生丢失，降解，其敏感性高到能够显示在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。正因为如此，对ISHH结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。

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