湖北双分子荧光互补技术-武汉贝科新肽公司(图)

构建亚细胞定位载体时，GFP融合位置为什么有N端、C端之分？

若序列中存在信号肽，则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果，例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果；融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。

为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？

不同物种的细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同，因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。

主要方法

免疫荧光技术：利用抗原与的特异性结合原理，将荧光标记的与细胞内的目标蛋白结合，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的位置，从而确定目标蛋白的亚细胞定位。

绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白技术：将绿色荧光蛋白基因与目标蛋白基因融合，构建成融合蛋白表达载体。当该载体在细胞中表达时，产生的融合蛋白会带有绿色荧光，可直接通过荧光显微镜观察其在细胞内的分布，进而确定目标蛋白的亚细胞定位。

细胞分馏和免疫印迹：先通过差速离心等方法将细胞匀浆分离成不同的亚细胞组分，如细胞核、线粒体、细胞质等。然后，利用免疫印迹技术，双分子荧光互补技术，使用针对目标蛋白的特异性来检测该蛋白在各个亚细胞组分中的存在情况，以此推断其亚细胞定位。

电子显微镜技术：包括免疫电镜技术等，可在超微结构水平上对细胞内的蛋白质等生物分子进行定位。通过将特异性与细胞内的目标蛋白结合，再用电子显微镜观察标记物的位置，能够地确定目标蛋白在细胞内的亚细胞定位。