贝科新肽(图)-植物原位杂交-原位杂交

原位杂交技术方法大致可分为：1.杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；2.杂交；3.杂交后处理；4.显示（visualization）：包括性自显影和非性标记的显色。固定原位杂交组织化学技术在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，染色体荧光原位杂交，如果要使RNA的降解减少到低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。

原位杂交第二天

1.

1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，原位杂交，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

2.

1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。

2）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。

3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连，4C 冰箱过夜。

荧光原位杂交（FISH）技术具有以下优点：

高特异性：荧光探针的合成是定向的，保证了杂交过程的特异性，植物原位杂交，可以有效地降低非特异性杂交和背景干扰。

高灵敏度：荧光信号的检测比性信号的检测更灵敏，原位杂交检测，可以检测出低拷贝数的DNA序列，甚至可以检测单个基因序列。

快速简便：FISH技术操作简便，杂交过程可以在数小时或数天内完成，而且不需要过于复杂的设备，便于在实验室开展。

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