武汉贝科新肽-蛋白互作

构建亚细胞定位载体时，GFP融合位置为什么有N端、C端之分？

若序列中存在信号肽，则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果，例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果；融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。

为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？

不同物种的细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同，蛋白互作，因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。

蛋白质序列特征：

利用改进型伪氨基酸组成法（PseAAC）、伪位置特异性得分矩阵法（PsePSSM）和三联体编码法（CT）对蛋白质序列进行特征提取，并将这三种方法得到的特征向量进行融合，以得到一个全新的蛋白质序列特征表达模型，然后输入到堆栈式降噪自编码器（SDAE）深度网络里自动学习更有效的特征表示，选用 Softmax 回归分类器进行亚细胞的分类预测，可有效提高蛋白质亚细胞定位预测的准确性。

利用 PSI-BLAST 工具搜索蛋白质序列，提取位点特异性谱中的位点特异性得分矩阵作为蛋白质的一类特征，并计算 4 等分序列的氨基酸含量以及 1～7 阶二肽含量作为另外两类特征，由这三类特征一共得到蛋白质序列的 12 个特征向量。通过设计一个简单加权函数对各类特征向量加权处理，作为神经网络预测器的输入，可提高蛋白质亚细胞定位预测的精度。

亚细胞定位原理

利用GFP、RFP等荧光蛋白具有的荧光性质和灵敏性，来示踪细胞内的蛋白。将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬转或稳转，使该融合蛋白在受体材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器，经过激光共聚焦显微镜激光照射，荧光蛋白会发出荧光，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，从而可以确定目标蛋白的亚细胞定位情况，即可对蛋白质进行准确定位。